De polymerasekettingreactie of PCR (polymerase chain reaction), is een laboratoriumtechniek waarmee een specifiek stukje DNA vele malen kan worden vermenigvuldigd (geamplificeerd). Uit een uiterst kleine hoeveelheid materiaal kan via PCR voldoende DNA worden verkregen voor verdere analyse. Sinds de ontwikkeling in de jaren 1980 door biochemicus Kary Mullis is PCR uitgegroeid tot een van de belangrijkste technieken in de moleculaire biologie.
PCR wordt breed toegepast in zowel fundamenteel onderzoek als in praktische domeinen zoals medische diagnostiek, forensisch onderzoek, genetische modificatie en infectieziektebestrijding. Dankzij PCR kunnen bijvoorbeeld virussen zoals hiv of SARS-CoV-2 worden opgespoord in een vroege infectiefase, wanneer er nog weinig genetisch materiaal aanwezig is. Ook wordt de techniek gebruikt om DNA-profielen te maken bij gerechtelijk onderzoek of om genetische mutaties op te sporen bij erfelijke aandoeningen.
De kracht van PCR ligt in het vermogen om uiterst nauwkeurig een specifiek DNA-fragment te vermenigvuldigen. Dit gebeurt met behulp van een enzym, DNA-polymerase, dat een nieuwe streng bouwt op basis van een bestaande DNA-template. Hierbij worden korte synthetische stukjes DNA, zogeheten primers, gebruikt om het beginpunt van de gekozen DNA-sequentie aan te geven. Het principe van PCR is gebaseerd op het herhaaldelijk verhitten en afkoelen van het DNA, die het DNA afwisselend denatureren, primers laten binden en nieuwe strengen laten vormen.
Geschiedenis Het principe van PCR werd al in de jaren 1970 beschreven, maar de uitvinding van de techniek wordt meestal toegeschreven aan de Amerikaanse biochemicus Kary Mullis in 1983. Mullis was werkzaam was bij het biotechbedrijf Cetus Corporation, waar hij zich bezighield met synthetische oligonucleotiden. Hij kwam op het idee om met behulp van korte primers en een DNA-polymerase een specifiek DNA-fragment cyclisch te vermenigvuldigen: in grote lijnen hetzelfde concept als PCR in zijn moderne vorm. In de beginjaren verliep het proces omslachtig, omdat men gebruik maakte van een polymerase uit E. coli, die niet hittebestendig was en bij iedere cyclus opnieuw moest worden toegevoegd. De ontdekking van Taq-polymerase, geïsoleerd uit de thermofiele bacterie Thermus aquaticus, maakte PCR veel efficiënter en praktischer, aangezien dit enzym bestand is tegen de hoge temperaturen die nodig zijn voor de denaturatie van DNA.
thumb|right|Baby Blue, een prototype uit 1986 van een automatische PCR-machine
Vanaf het midden van de jaren tachtig verspreidde PCR zich naar andere delen van de wereld via onderzoekslaboratoria, zo ook in Nederland en België. De techniek vond zijn toepassing aanvankelijk vooral in de klinische diagnostiek, bijvoorbeeld van hiv-infectie. Veiligheidsdiensten zoals de FBI begonnen de techniek begin vanaf 1986 ook voor het eerst te valideren voor forensisch sporenonderzoek. In 1989 verkocht Cetus de rechten op PCR aan Roche, wat de commerciële verspreiding verder versnelde. In de jaren daarna volgden technologische verfijningen van het systeem, en afgeleide technieken zoals kwantitatieve PCR. Het laatste commerciële PCR-octrooi verliep in 2017.
Kary Mullis ontving in 1993 de Nobelprijs voor Scheikunde voor de uitvinding, samen met Michael Smith, die werd bekroond voor zijn werk aan gerichte mutagenese met oligonucleotiden. Hoewel Mullis' ontdekking in eerste instantie sceptisch werd ontvangen door collega's, wordt zijn idee erkend als een van de meest invloedrijke biochemische innovaties van de twintigste eeuw.
Werking van de reactie
De uitvinding van PCR was een mijlpaal in de moleculaire biologie en betekende een doorbraak in de manier waarop men werkt met DNA en RNA. Het stelde onderzoekers in staat om een stukje genetisch materiaal, zoals een gen of andere sequentie, selectief te vermenigvuldigen in een reageerbuis. Tot aan de jaren 1980 gebeurde dit meestal aan de hand van kloneringsmethoden in bacteriën, een langzaam en arbeidsintensief proces. Omdat bacteriën bij PCR niet nodig zijn, is de techniek snel en eenvoudig uitvoerbaar: het genereert miljarden kopieën van een DNA-fragment in enkele uren. Uitgaande van het totale genoom, kan men met PCR een gewenst stukje DNA – geselecteerd door de onderzoeker – door vermenigvuldiging 'zuiveren' van de rest van het genetisch materiaal, dat niet wordt vermenigvuldigd. et al, pp. 506–510
De kunstmatige vermenigvuldiging van nucleïnezuren, ook wel amplificatie genoemd, is exponentieel van aard. Dit betekent dat zelfs minuscule hoeveelheden van een nucleïnezuur snel kunnen worden vermeerderd tot detecteerbare niveaus. De PCR-techniek is bijvoorbeeld gevoelig genoeg om sporen van DNA te detecteren in een druppel bloed die achtergelaten is op een plaats delict, of om enkele kopieën van een virusgenoom in iemands speeksel aan te tonen.
Componenten en reagentia thumb|upright=1.15|De reactiemengsels voor PCR worden vaak in kleine buisjes (van 20–50 microliter) gereedgemaakt.
Om een PCR uit te voeren, wordt het DNA (geïsoleerd uit een monstermateriaal) in een buisje gemengd met een aantal reactiecomponenten. Een hoofdrol speelt DNA-polymerase, een enzym dat de taak heeft om het aangeleverde DNA te kopiëren. Omdat tijdens PCR verhit wordt naar hoge temperaturen, moet het gebruikte enzym hittebestendig zijn. Thermostabiele polymerasen – zoals het klassieke Taq-polymerase uit de warmteminnende bacterie Thermus aquaticus – bleken hiervoor ideaal. In de loop der jaren zijn er vele varianten op de markt gekomen, sommige geoptimaliseerd voor snelheid, andere voor nauwkeurigheid.
Om DNA te kopiëren, heeft het polymerase een zogeheten primer nodig: een kort DNA-fragment van 18–25 nucleotiden dat een beginnetje vormt en dus bepaalt waar de polymerisatie van start gaat. Voor de reactie zijn altijd twee verschillende primers nodig: één voor elke streng van het dubbelstrengse DNA. De primers worden door de onderzoeker ontworpen en chemisch gesynthetiseerd. DNA-primers kunnen zo worden ontworpen dat ze elke gewenste positie in een genoom herkennen. Door te binden aan de complementaire sequenties van het genetisch materiaal, leiden zij het polymerase naar het deel van het genoom dat moet worden gekopieerd.
Naast het DNA-polymerase en primers worden er nog een aantal andere stoffen toegevoegd aan de reactiemix. De reactie heeft een fikse hoeveelheid vrije nucleotiden (dNTP's) nodig: dit zijn de bouwstenen die ingebouwd worden in de groeiende DNA-keten. Verder bevat de reactiemix een buffer om pH en zoutconcentraties te stabiliseren, en magnesiumionen (toegevoegd als magnesiumchloride), die nodig zijn voor de activiteit van het polymerase. Alle componenten van de reactie zijn commercieel verkrijgbaar en worden meestal ingekocht. De reagentia worden in kleine buisjes gepipetteerd in vaste hoeveelheden; een voorbeeld van een standaard PCR-mix is hieronder weergegeven.
Component Volume PCR-buffer 5,0 μL dNTP-mix (10 mM) 1,0 μL Twee primers (10 μM) 2,5 μL Template-DNA 1,0 μL DNA-polymerase 0,5 μL Steriel water 37,0 μL
Reactieverloop thumb|upright=1.1|Principe van PCR. Het DNA wordt kortstondig verhit zodat de strengen uit elkaar gaan (denaturatie). Dan wordt het DNA afgekoeld zodat de primers kunnen hechten aan de randen van het te vermenigvuldigen fragment (annealing). Vervolgens wordt verwarmd tot de optimale temperatuur van de polymerase (elongatie).
Het principe van PCR berust op het achtereenvolgens verhitten en afkoelen van de reactiemix. De reactie is iteratief, wat wil zeggen dat dezelfde amplificatiestappen herhaaldelijk worden uitgevoerd in opeenvolgende cycli. De PCR-cyclus bestaat globaal uit drie stappen: denaturatie, annealing en elongatie.
Denaturatie (ca. 94–96 °C). De reactiemix wordt verhit, waardoor de twee strengen van het dubbelstrengse DNA uit elkaar gaan. De hitte zorgt ervoor dat de waterstofbruggen tussen de complementaire DNA-ketens loslaten. Hierdoor ontstaan enkelstrengs DNA-moleculen die als matrijs (template) dienen voor de volgende stap. Annealing (ca. 55–65 °C). De temperatuur wordt verlaagd zodat de korte primers kunnen binden aan hun complementaire sequenties op het enkelstrengs DNA. Deze primers markeren de linker- en rechtergrens van het DNA-fragment dat moet worden vermenigvuldigd. De annealingtemperatuur hangt af van het smeltpunt (Tm) van de primers en bepaalt de specificiteit van de PCR. Elongatie (ca. 72 °C). Het DNA-polymerase begint met het inbouwen van nieuwe nucleotiden. De nucleotiden worden toegevoegd aan het 3'-uiteinde van de gebonden primers (de primers worden 'verlengd'). Zo wordt op elke enkelstrengs keten een nieuwe complementaire streng gevormd. Na deze stap is de hoeveelheid dubbelstrengs DNA verdubbeld.
Na afloop van elke cyclus dienen de nieuw gemaakte DNA-moleculen als sjabloon voor de volgende ronde. Dit proces herhaalt zich 20–30 keer, waardoor er miljarden kopieën van het gekozen DNA-fragment ontstaan. In moderne laboratoria wordt het reactieproces automatisch uitgevoerd in een PCR-machine. Het succes van PCR is een kwestie van juist getimede temperatuursveranderingen. Optimalisatie van de reactiecondities is een proefondervindelijk proces.
Omdat in elke cyclus het aantal DNA-moleculen verdubbelt, neemt de hoeveelheid product exponentieel toe. In theorie zou elke cyclus een exacte verdubbeling opleveren (2n), maar in de praktijk daalt de efficiëntie geleidelijk naarmate de reactie vordert. Dit komt doordat de concentratie van primers en nucleotiden afneemt en het enzym minder actief wordt.
Detectie van het PCR-product Na afloop van een PCR-reactie wordt vaak gecontroleerd of de amplificatie is geslaagd en het juiste fragment is verkregen. Dit gebeurt doorgaans met behulp van een agarose-gelelektroforese, een techniek waarmee men DNA-fragmenten op lengte kan scheiden en daarna zichtbaar kan maken met een fluorescente kleurstof. De PCR-producten worden in de gel in kleine holtes geplaatst (geladen) en onder invloed van een elektrisch veld bewegen de fragmenten door de gel. Kleinere fragmenten gaan sneller en komen verder, grotere fragmenten migreren trager. Zo ontstaat er een scheiding van het DNA naar fragmentgrootte.
thumb|upright=1.1|Resultaat van een agarose-gel met PCR-producten geladen. De DNA-ladders zijn uiterst links en rechts zichtbaar; de 16 lanen in het midden tonen verschillende DNA-fragmenten, verkregen door PCR, gescheiden op lengte.
Wanneer de gel onder speciaal licht wordt bekeken, verschijnen de DNA-fragmenten als bandjes. Elk bandje vertegenwoordigt een groep fragmenten van ongeveer dezelfde lengte. Door dit bandenpatroon te vergelijken met een standaard, de zogeheten DNA-ladder (die een reeks fragmenten van bekende groottes bevat), kan worden vastgesteld of het juiste PCR-fragment aanwezig is. De aanwezigheid van een specifieke band kan bijvoorbeeld dienen als bewijs voor de aanwezigheid van een virus in het oorspronkelijke DNA-monster.De gebruikte primer wordt zo ontworpen dat deze een specifiek deel van het virusgenoom herkent, maar niet van andere virussen of het menselijk DNA. Omdat men met gelelektroforese alleen de aan- of afwezigheid van een PCR-product kan zien, wordt deze uitleesmethode kwalitatief genoemd.
Na deze eerste controle zijn er verschillende vervolgstappen mogelijk, afhankelijk van het doel van de PCR. Als het juiste fragment aanwezig is, kan het PCR-product worden opgestuurd voor sequencing, om de exacte basenvolgorde vast te stellen. Als men het fragment wil gebruiken voor genetische technologie of expressie van een recombinant eiwit, kan het worden ingebouwd in een vector voor klonering.
Variaties en technieken Kwantitatieve PCR