thumb|upright=1.1|Moderne, high-throughput DNA-sequencers
DNA-sequencing is het proces waarbij de volgorde (sequentie) van nucleotiden in het DNA wordt vastgesteld. DNA-sequencing omvat alle methoden en technieken die onderzoekers gebruiken om de volgorde van de vier basen te bepalen: adenine, guanine, cytosine en thymine. De opkomst van snelle sequencing-methoden sinds de jaren 2000 vormde de basis voor vele belangrijke biologische en medische ontwikkelingen.
Kennis van DNA-sequenties is van essentieel belang voor fundamenteel biologisch onderzoek en wordt praktisch toegepast in andere disciplines, zoals klinische genetica, biotechnologie, forensisch onderzoek, virologie en fylogenetica. Door het genetisch materiaal tussen individuen te vergelijken kan bijvoorbeeld een ziekte worden gediagnosticeerd, een misdadiger worden opgespoord, geïndividualiseerde medische zorg worden verleend en kunnen nieuw ontdekte organismen worden geïdentificeerd en gecatalogiseerd.
De eerste DNA-sequenties werden begin jaren zeventig van de twintigste eeuw vastgesteld met behulp van eenvoudige methoden op basis van tweedimensionale chromatografie. Na de ontwikkeling van sequentiemethoden op basis van fluorescentie is DNA-sequencing veel goedkoper en ordes van grootte sneller geworden. Moderne DNA-sequencingtechnologieën zijn noodzakelijk bij het ontcijferen van genomen. Van vele honderden organismen, waaronder de mens, is het genoom in groot detail vastgesteld.
Geschiedenis Ontdekking van DNA In 1953 stelden James Watson en Francis Crick het klassieke helixmodel van DNA voor, gebaseerd op röntgenkristallografie die door Rosalind Franklin was vastgesteld. Het model stelde dat DNA uit twee strengen nucleotiden bestaat die in de vorm van een dubbele helix met elkaar vervlochten zijn. Elke streng bestaat uit vier nucleotiden – adenine (A), cytosine (C), guanine (G) en thymine (T) – waarbij een A op de ene streng via waterstofbruggen verbonden is met T, en C met G. Door middel van deze complementariteit kan de DNA-code tijdens replicatie in stand blijven en doorgegeven worden aan nieuwe cellen.
thumb|220px|Frederick Sanger, pionier op het gebied van sequencing. Sanger is een van de weinige wetenschappers die twee Nobelprijzen heeft ontvangen; een voor sequencing van eiwitten en de andere voor de sequencing van DNA.
Watson en Crick hadden nog niet verklaard hoe de nucleotidenvolgorde in DNA verbonden was met de synthese van eiwitten. Hier kwam verandering in toen Frederick Sanger in 1955 de volgorde van aminozuren (de eiwitsequentie) van insuline had vastgesteld. Zijn werk vormde het eerste bewijs dat eiwitten moleculen waren met een specifieke moleculaire opbouw. Crick woonde een aantal lezingen van Frederick Sanger bij in oktober 1954, en ontwikkelde een theorie die stelde dat de rangschikking van nucleotiden in het DNA de volgorde van aminozuren in eiwitten bepaalt, wat op zijn beurt de functie van een eiwit bepaalt. Crick publiceerde deze theorie in 1958. Marks, L. The path to DNA sequencing: The life and work of Frederick Sanger.
Vroege sequence-methoden Het bepalen van de nucleotidevolgorde van DNA werd voor het eerst uitgevoerd in 1970 aan de Cornell-universiteit. Onderzoekers maakten gebruik van een locatie-specifieke primer. De primer werd gebonden aan de DNA-keten en was een aanknopingspunt voor polymerisatie van gelabelde nucleotiden. Met deze eenvoudige methode kon een klein gedeelte van het DNA van een bacteriofaag gesequencet worden.
Frederick Sanger nam vervolgens deze primer-extensiestrategie over om snellere DNA-sequentiemethoden te ontwikkelen in het MRC Centre (Cambridge) en publiceerde in 1977 een methode voor "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors". Verdere ontwikkelingen van deze sequence-methode gingen hand in hand met de gelijktijdige ontwikkeling van recombinant-DNA-technologie, waardoor DNA-monsters konden worden geïsoleerd uit andere bronnen dan enkel virussen.
Sequencing van gehele genomen thumb|left|upright|Het genoom van de bacteriofaag φX174, bestaande uit 5386 basenparen. Elk gekleurd blokje vertegenwoordigt een gen.
Het eerste genoom dat in zijn geheel is gesequencet was dat van de bacteriofaag φX174 in 1977. Dit virus had een relatief kort genoom en het DNA was bovendien eenvoudig te zuiveren. In de jaren die volgden werd ook van andere virussen het genetisch materiaal ontcijferd. Voor het eerst in de geschiedenis kon men een volledige sequencing uitvoeren zonder voorafgaande kennis van het genetisch profiel van het betreffende organisme."The Next Frontier: Human Viruses" , whatisbiotechnology.org, geraadpleegd op 26 januari 2020.
Een niet-radioactieve methode voor het overbrengen van de DNA-moleculen na sequentiebepaling op een immobiliserende matrix voor elektroforese werd ontwikkeld in de jaren 1980. Rond 1990 begon de National Institutes of Health (NIH) met grootschalige sequentietesten op Mycoplasma capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans en Saccharomyces cerevisiae. Ondertussen begon men met het sequencen van menselijke cDNA-sequenties, de zogeheten expressed sequence tags, in het laboratorium van Craig Venter. Dit was een poging om het coderende gedeelte van het menselijke genoom vast te stellen. In 2001 waren al kleine delen van het menselijk genoom bepaald door middel van shotgun sequencing.
Next-generation sequencing Rond het jaar 2000 werden nieuwe methoden van DNA-sequencing ontwikkeld die sneller dan ooit tevoren de DNA-code konden ontcijferen. Deze methoden werden next-generation sequencing of high-throughput sequencing genoemd, om hen te onderscheiden van de conventionelere methoden, zoals Sanger sequencing. In tegenstelling tot first-generation sequencing, konden next-generation-technieken het gehele genoom van een organisme in één keer sequencen. Hiervoor wordt het DNA eerst gefragmenteerd in kleine stukken. Van deze stukken wordt dan de nucleotidevolgorde bepaald door middel van verschillende geautomatiseerde sequence-methoden. Via overlappende sequenties kan het gehele genoom worden gereconstrueerd.
Basismethoden Maxam-Gilbert-sequencing In 1977 publiceerden de moleculair biologen Allan Maxam en Walter Gilbert een nieuwe DNA-sequencingtechniek die gebaseerd was op de chemische modificatie van DNA en het afsplitsen van specifieke basen. Deze techniek kwam ook wel bekend te staan onder de naam chemical sequencing. Met deze methode kon gezuiverd dubbelstrengs-DNA worden gesequencet zonder verdere klonering. Doordat men gebruik moest maken van radioactieve labeling en vanwege de technische complexiteit raakte deze techniek steeds minder in zwang.
Bij Maxam-Gilbert-sequencing wordt het 5'-uiteinde van het gezuiverde target-DNA radioactief gelabeld. Na behandeling met chemicaliën ontstaan er breuken bij een of twee van de vier nucleotidebasen in elk van de vier reacties (G, A+G, C, C+T). De concentratie van de modificerende chemicaliën wordt zo gehouden dat er gemiddeld één modificatie per DNA-molecuul optreedt. Op deze manier wordt een reeks gelabelde fragmenten gegenereerd: vanaf het radioactief gelabelde uiteinde tot de eerste "breuk" in het molecuul. De fragmenten in de vier reacties worden vervolgens naast elkaar op lengte gescheiden via gelelektroforese. De fragmenten in de gel kunnen zichtbaar gemaakt worden door autoradiografie. Het resultaat is een reeks donkere banden die elk overeenkomen met een radioactief gelabeld DNA-fragment, waaruit de sequentie kan worden afgeleid.
Sanger-sequencing Sanger-sequencing of didesoxysequencing werd ontwikkeld door Frederick Sanger en zijn team in 1977. Deze sequencingtechniek werd al snel zeer populair, voornamelijk omdat de techniek relatief makkelijk uitvoerbaar was en redelijk betrouwbare resultaten gaf. Vanwege het gemak werd de Sanger-methode geautomatiseerd en groeide de methode uit tot het representatieve voorbeeld van first-generation sequencing.
Sanger-sequencing bestaat uit een speciale PCR gevolgd door gelelektroforese. Bij de speciale PCR worden, behalve het te onderzoeken DNA, DNA-polymerase, DNA-nucleotiden en primers, ook didesoxynucleotiden (ddA, ddC, ddG en ddT) toegevoegd. Dit zijn moleculen die op normale nucleotiden lijken, maar geen OH-groep hebben aan hun 3’-uiteinde. Hierdoor stopt de DNA-replicatie nadat er een didesoxynucleotide is ingebouwd. Aan elk van de vier didesoxynucleotiden is bovendien een stof gebonden die in een bepaalde kleur fluoresceert. Na replicatie zijn er heel veel gelabelde DNA-fragmenten ontstaan die in lengte verschillen.
Door gelelektroforese kunnen deze DNA-fragmenten, onder invloed van elektrische spanning, in een gel op lengte worden gescheiden. De gel (van polyacrylamide) bestaat uit een netwerk van vezels die een moleculaire zeef vormen. De gel wordt in een bufferoplossing gelegd. Het mengsel van DNA-fragmenten wordt aangebracht aan de kant van de negatieve pool van de opstelling. Doordat DNA-fragmenten negatief geladen zijn, bewegen ze zich in de gel naar de positieve pool zodra er spanning op de gel wordt gezet. Hoe kleiner de DNA-fragmenten zijn, hoe sneller ze door de poriën in de gel kunnen bewegen. Na gelelektroforese, met in elk slotje een aparte didesoxynucleotide, kan men vanaf beneden aflezen wat de nucleotidevolgorde is. De gevormde sequentie leest men van 5’ naar 3’.
Large-scale sequencing Klonering en genoomassemblage thumb|DNA wordt gefragmenteerd, in vectors geplaatst, en vervolgens gekloneerd in bacteriën. Van iedere individuele kloon bepaalt men dan de sequentie, die later worden samengevoegd via de overlappende delen. Sequencing van grote stukken DNA, bijvoorbeeld hele chromosomen of hele genomen, werd mogelijk vanaf de jaren 1990. Om het DNA van een volledig chromosoom te ontcijferen, is het noodzakelijk het DNA eerst op te splitsen in duizenden kleine fragmenten. Hiervoor gebruikt men vaak restrictie-enzymen of mechanische technieken die het DNA-molecuul uiteen doen vallen. Het gefragmenteerde DNA wordt vervolgens gekloneerd in een vector en daarna vermenigvuldigd in een bacteriële gastheer zoals Escherichia coli. Het DNA isoleert men uit de bacteriekolonies en van de fragmenten wordt individueel de sequentie bepaald. Met behulp van een computer kunnen de sequenties via overlappende delen worden samengevoegd, zodat uiteindelijk de sequentie van het hele chromosoom kan worden gereconstrueerd. Deze methode is op diverse punten geoptimaliseerd en daardoor nog steeds in gebruik. (2003). Large Scale Sequencing. Current Protocols in Bioinformatics. .
Het in elkaar zetten van genomen door overlappende stukken aaneen te sluiten heet genome assembly of in het Nederlands genoomassemblage. Genoomassemblage – betekenis en definitie, Ensie.nl, 08-05-2020, geraadpleegd op 16 mei 2020. Door elk stukje van het genoom meerdere keren te sequencen, bijvoorbeeld twintig keer, vergroot men de 'coverage' (leesdiepte) en kunnen polymorfismen, mutaties en leesfouten uit de uiteindelijke assembly worden weggefilterd. Het resultaat van een genoomassemblage is een consensussequentie en is meestal een nauwkeurige reconstructie van het grote stuk DNA.
De-novo-sequencing